• 共價結(jié)合，可實現(xiàn)穩(wěn)健，可靠，可重復的側(cè)向流動分析

nanoComposix是精密工程和高度特征化納米粒子制造商。我們的使命是幫助我們的客戶將納米技術(shù)產(chǎn)品推向市場。我們的多學科技術(shù)團隊提供快速原型設計，表征，集成和擴展解決方案，以加速各種應用領域的研發(fā)和商業(yè)化，包括生物診斷，局部治療，納米醫(yī)學，抗菌涂層和色彩工程。

自2004年以來，nanoComposix已為數(shù)千名客戶提供單分散和非團聚金屬和金屬氧化物納米材料。數(shù)百種不同的材料，尺寸，形狀和表面可供選擇，我們已經(jīng)生產(chǎn)了2000多種定制的核/殼，生物功能化，熒光和磁性納米復合材料，以滿足客戶的要求。NanoComposix生產(chǎn)了NIST納米銀參考材料，我們的顆粒已被用于400多篇同行評審的出版物中。我們所有的材料都提供分析證書，包括電子顯微鏡，流體動力學直徑和每批次的光學數(shù)據(jù)，以保證產(chǎn)品符合規(guī)格。合同制造的規(guī)模從小燒杯到數(shù)千升不等。用于醫(yī)療設備和臨床試驗的納米材料在我們的ISO13485和cGMP兼容潔凈室設施中生產(chǎn)。通過利用我們*的納米材料庫，我們的目標是幫助客戶快速將納米技術(shù)產(chǎn)品從概念轉(zhuǎn)化為商業(yè)化。

側(cè)流檢測是一種快速、獨立的診斷試驗，可以檢測出各種分析物.該測試價格低廉，攜帶方便，可在常溫下儲存，并有很長的貨架壽命。 e.該分析提供診斷結(jié)果，不需要樣品處理或額外設備，使這種格式為理想的護理點和現(xiàn)場診斷。每一個側(cè)面的關(guān)鍵部件 W檢驗是用分子識別元件(通常是抗體)涂層的檢測器粒子。在橫向流動檢測中常用的一種檢測粒子是金納米粒子wh。 Ich有非常大的吸收截面，使它們在綁定到測試行時易于可視化(參見圖1)。制備金共軛探測器粒子的分子識別方法 ENT必須與金顆粒的表面結(jié)合。一個創(chuàng)建這些抗體綴合物的方法是簡單的混合顆粒的金納米粒子和抗體結(jié)合在一起，使抗體 通過物理吸附與金納米顆粒表面結(jié)合。雖然這通常是成功的，但每一種生理吸附結(jié)合都必須根據(jù)鹽濃度、pH和抗體/部分進行優(yōu)化。 柱比在某些情況下，抗體與粒子表面的結(jié)合較弱，抗體可與表面解離，有可能破壞粒子的穩(wěn)定或降低pa。 質(zhì)膜對分析物的結(jié)合親和力。另一種將抗體與粒子表面結(jié)合的方法是使用共價化學。共價結(jié)合提供了許多優(yōu)點 clouding暗晦，濕潤，

在更大范圍的樣本矩陣中增加共軛穩(wěn)定性

對粒子/抗體比率的更大控制

減少尋找適合抗體對所需的共軛反應次數(shù)

本白pi書提供了關(guān)于如何通過共價結(jié)合形成健壯和可靠的抗體結(jié)合的附加信息。

共價結(jié)合粒子

納米復合物為共價結(jié)合提供了三種不同的生物制備納米粒子：40 nm直徑的金納米球，80 nm直徑的金納米球和150 nm直徑的金納米。粒子Ar E功能化的脂聚乙二醇酸(用于納米球)或硫辛酸(用于納米)，以產(chǎn)生一個強大的羧基表面，共價結(jié)合在選定的靶向劑上的游離胺。共價 酰胺鍵之間的羧基和自由胺是通過EDC/Sulfo-NHS中間實現(xiàn)的(圖2)。對于抗體來說，賴氨酸殘基是EDC/NHS結(jié)合的主要靶位點。一個 典型IgG抗體有80~100個賴氨酸殘基，其中30~40個可與EDC/NHS結(jié)合。蛋白質(zhì)，如牛血清白蛋白，有相似數(shù)量的可接近賴氨酸基團。 .

在共軛之前，抗體溶液在儲存緩沖液中不含有額外的游離胺是至關(guān)重要的，因為游離胺將與納米粒子上的結(jié)合位點競爭。f Ree胺，包括在Tris緩沖液或防腐劑sodium azide;  中發(fā)現(xiàn)的，必須除去，抗體必須轉(zhuǎn)移到合適的氨基緩沖液中。一種常見的執(zhí)行此操作的方法 洗滌步驟是使用自旋列(圖3)。此外，抗體溶液中的任何附加穩(wěn)定蛋白也必須去除。蛋白質(zhì)A或其他親和柱可用于 其他蛋白質(zhì)的抗體。蛋白質(zhì)純化應該首先進行，因為從親和柱中洗脫抗體通常需要使用含有胺的緩沖液。潛艇 然后需要將抗體依次純化成無胺緩沖液.抗體純化的步驟詳見下文。

材料( material的名詞復數(shù) )

微孔超0.5mL 10K蛋白質(zhì)純化和濃縮過濾器(目錄#UFC 5096)

2毫升微離心管可容納過濾器

微型離心機

需純化的抗體(例如，每個過濾器的抗體為0.1至2毫克)

·純化緩沖液(例如10毫米磷酸鉀或其他無胺緩沖液)

蛋白質(zhì)定量用bca檢測試劑盒和平板閱讀器或紫外-可見分光度計

凈化協(xié)議

在微離心管內(nèi)放置過濾器。

加入450升純化緩沖液，在13.8K RCF離心5分鐘，預沖洗濾池。

將濾液處理到管子底部。

ALI抗體溶液進入過濾器并關(guān)閉蓋子。該過濾器可容納500微升，如果凈化體積超過這一能力，離心機濃縮和添加更多的未純化抗體之前。 繼續(xù)清洗步驟。如果初始抗體量小，則加入緩沖液，可達~450μL的總體積。

用13.8K RCF離心5分鐘濃縮。

從微離心管中取出含有濃縮抗體的過濾器。從微離心管底部取出濾液。

注：濾液可從清潔容器內(nèi)的所有洗滌步驟中保留下來。如果由于穿透濾池而產(chǎn)率特別低，則可從保留的濾液中回收抗體。

將含有濃縮抗體的過濾器放回試管中，并在濾池中加入350毫升的純化緩沖液。

在13.8K RCF離心5分鐘，洗滌/濃縮。

重復洗滌程序(步驟5-7)，再用350毫升的額外凈化緩沖液洗滌四次，共洗滌五次。

后一次清洗后，將設備倒轉(zhuǎn)到一個新的，清洗2毫升微離心管，并切斷蓋子。在1k RCF離心5 min，收集純化和濃縮抗體。奧普提 Mal恢復，立即進行反向旋轉(zhuǎn)。

將抗體溶液后濃度為≥1mg/mL保存。純化后，典型的推薦儲存方法是將純化的抗體≥1 mg/mL保存在螞蟻的基礎上。 供應商的分析證明。一般來說，應避免凍結(jié)/解凍循環(huán)。關(guān)于建議的儲存和處理程序，請參考抗體供應商的說明。

確定終蛋白質(zhì)濃度

現(xiàn)在你已經(jīng)純化了你的抗體，確定終的蛋白質(zhì)濃度是很重要的。這可以通過一種基于SPECT中280 nm處溶液吸光度的方法來實現(xiàn)。 分光度法(A 280法)或二異氰酸酯(BCA)法。

1. 大樣本回收率

2. 精礦中樣品回收率低可能是由于吸附損失、濃度過高或樣品通過膜造成的。若要大限度地提高樣品回收率，請確保吸管針尖不起作用。 他沒有刺破濾膜。吸附損失取決于溶質(zhì)濃度、疏水性、溫度、與過濾裝置表面的接觸時間、樣品組成和pH值。到 盡量減少損失，離心后立即取出濃縮樣品。如果起始樣品濃度較高，請監(jiān)測離心過程，以避免過濃。 樣本。過量的濃度會導致沉淀和潛在的樣品損失.如果樣品似乎通過膜，選擇一個較低的名義相對分子質(zhì)量限制(NMWL)amico。 n超-0.5濾波器單元。收集濃縮/純化抗體后，可用少量純化緩沖液沖洗濾池內(nèi)幾次，回收任何抗體t。 帽子可能在濾膜上。

3. 結(jié)合協(xié)議：步驟2：抗體結(jié)合

4. 抗體可以通過碳二亞胺交聯(lián)化學(EDC)與納米顆粒表面的端羧基結(jié)合。EDC與羧酸基團反應 形成活性酯中間體?；腔疦HS的加入提高了中間體的溶解度和穩(wěn)定性，該中間體與抗體的胺基團發(fā)生反應，形成穩(wěn)定的酰胺鍵Be。 抗體和納米粒子之間。下面的方法描述了羧基功能化納米粒子的抗體結(jié)合步驟。

5. 所需材料

6. 40 nm直徑生物制備羧基金納米粒子

7. 不加任何游離胺的純化抗體

8. 反應緩沖液(5毫米磷酸鉀，0.5%20 KmW PEG，pH 7.4)

9. European Defence Community歐洲防務集團

10. 羥基硫代琥珀酰亞胺

11. 猝滅劑（50%（W/V）羥胺）

12. 共軛稀釋劑(0.1x PBS，0.5%BSA)

13. 離心機

14. 標準微離心管(沒有特殊處理或殘留增塑劑)

15. [航]渦流

16. 旋轉(zhuǎn)者，轉(zhuǎn)動體

17. 共軛協(xié)議

18. 提出了40 nm直徑羧基金納米粒子在OD 20處1mL的共軛策略，在OD 20處產(chǎn)生1mL的抗體-金共軛物。適用于較大或較小的體積 MES，比例按比例或遵循特定的共軛協(xié)議提供的每個生物反應的羧基變體。

19. 重要事項：步驟1-6應在溶解EDC/Sulfo-NHS后立即完成，以盡量減少Sulfo-NHS酯在水中的水解，并提高共軛效果。

20. 在接枝前用10 mg/mL的H2O制備EDC和Sulfo-NHS。

21. 小貼士：確保EDC和磺胺類NHS試劑在打開小瓶前保持室溫。在每個微離心管中分別稱重1-10毫克EDC和磺基NHS。就在前面 在適當體積的H2O中溶解，使其濃度達到10 mg/mL。

22. 例子：EDC質(zhì)量=2.38mg，添加238 LH2O質(zhì)量為Sulfo-NHS=6.14毫克，添加614升H2O

23. 在40 nm羧基金納米粒子的1mL中加入200μg的EDC(20 L新鮮制備的EDC，在H2O中10 mg/mL)和400 g的Sulfo-NHS(40 L的新制備的Sulfo-NHS，在H2O中濃度為10 mg/mL)。

24. 漩渦溶液在室溫下旋轉(zhuǎn)30分鐘

25. 在3600 RCF離心10分鐘。

26. 小心移除上清液，去除任何過量的EDC/Sulfo-NHS，并在1mL反應緩沖液中重新懸浮。旋渦和(或)聲波使粒子*重新懸浮。

27. 加入抗體和漩渦溶液。

28. 旋轉(zhuǎn)時，在室溫下孵育2小時。請注意，較短或較長的孵育時間可能會提高結(jié)合的效果。

29. 孵化后，添加10升昆徹，以使任何剩余的NHS-酯類物質(zhì)失活.旋轉(zhuǎn)時，在室溫下旋轉(zhuǎn)10分鐘。

30. 在3600 RCF離心10分鐘。小心去除上清液，并在1mL反應緩沖液中重新懸浮.旋渦和/或聲納以*重新懸浮共軛。

31. 重復離心和再懸浮以去除多余的抗體。

32. 再在3600 RCF離心10分鐘，取出上清液，用共軛稀釋劑使體積達到1mL。旋渦和/或聲納以*重新懸浮共軛。

33. 在4°C保存共軛物，不要凍結(jié)。

優(yōu)化共軛的附加提示

需要注意的是，宜的結(jié)合步驟是依賴于抗體的，并且抗體之間的優(yōu)化技術(shù)會有所不同。共軛物在溶液中應該是穩(wěn)定的，并且 與抗原有效而特異的結(jié)合。以下提示可以提高共軛的效率：

在pH值為5的條件下，EDC和Sulfo-NHS對羧酸基團的活化效果適。

當pH值為7~7.5時，伯胺對抗體與活性羧基發(fā)生反應的pH值高。在較高的pH值下進行反應，大大降低了.的半衰期。 NHS-酯中間體。

結(jié)合過程中抗體的濃度和抗體與納米粒子的孵育時間可進行調(diào)節(jié)，以確定宜條件。

共軛稀釋劑組分可以調(diào)整，以確定宜緩沖摩爾度，pH，阻滯劑，聚合物和表面活性劑。

共軛協(xié)議：步驟3：描述共軛

對共軛物的表征對于確?？贵w結(jié)合在粒子表面和共軛物是穩(wěn)定的是至關(guān)重要的。紫外可見光譜儀是一種可以利用的工具。 ED通過觀察等離子體共振吸收來評價其穩(wěn)定性。納米粒子在共軛前后的共振峰位置有輕微的變化，表明抗體具有 成功地與表面結(jié)合。如果共軛物聚集，峰移并變得更寬（圖4）。動態(tài)光散射是另一種可用于篩選SMA的工具。 通過測定流體力學尺寸和多分散性指數(shù)，得到聚集量。橫向流動試驗條也是評價共軛性能的一種有效方法，同時也是一種輔助手段。 申請這樣的結(jié)合。側(cè)流測試條可以含有與納米顆粒結(jié)合的抗體的特異性試劑，并提供了一種快速、簡便的檢測方法。 研究抗體是否成功結(jié)合并保持功能。

批量大小和每條帶鋼的價格

生物制備羧基粒子是在納米復合材料的ISO 13485符合質(zhì)量體系，確保高批號-批次一致性的粒子性質(zhì)。地段大小可達400，000 OD-MLS( 相當于1 OD金400 L)，單批可產(chǎn)生約1，000，000條。在供應合同中，客戶可以保留特定的批次，以便在一年內(nèi)從同一批中取樣。 ，在切換到新批次時，由于重新優(yōu)化而減少任何停機時間。大量生產(chǎn)也使我們能夠以競爭力的價格提供具有廣泛特色的產(chǎn)品。什么時候 比較供應商定價，重要的是要調(diào)整為不同數(shù)量和不同濃度供應的價格。為了規(guī)范定價，我們通常用OD-mL來討論成本。 簡單的價格除以產(chǎn)品的OD溶液和體積。例如，如果在10 OD濃度下，100 mL體積的金納米粒子的成本為600美元，那么每OD-mL的成本為600美元。 /(100*10)=0.60美元。與其他許多供應商不同，我們的共價耦合解決方案具有*的成本效益，終成本僅略高于物理吸附產(chǎn)品的成本。 離子。當您考慮到開發(fā)時間更快、在各種樣品介質(zhì)中更穩(wěn)定、每個粒子的抗體使用量更低、以及更好地控制抗體/粒子的優(yōu)點時， e比率，在許多情況下，使用共價結(jié)合可以降低凈成本和提高性能。

請隨時與我們的銷售人員聯(lián)系，提供報價或獲得更多的共價綁定幫助。

結(jié)論

我們的生物準備羧基金是一種簡單和成本效益的方法，以創(chuàng)造敏感，穩(wěn)健和可靠的金共軛物。我們有許多客戶無法做出穩(wěn)定的共軛w。 被動吸附，但與共價結(jié)合成功。在競爭性橫向流動測試中，顆粒表面的抗體數(shù)量對于調(diào)節(jié)動力至關(guān)重要。 C值范圍內(nèi)，共價結(jié)合增加了對顆粒/抗體比值的控制。由于共價結(jié)合比被動吸附更有效，抗體量的減少 當使用昂貴的抗體時，需要建立一個測試可以導致化驗成本的凈減少。在我們手中，共價結(jié)合的優(yōu)點是快速清除抗體PAI的能力。 由于不再需要掃描每個納米粒子共軛物的鹽和pH，因此標準的EDC/NHS結(jié)合條件通常是次起作用。如果你還沒試過Coval 目前還沒有綁定，請與我們聯(lián)系，以幫助粒子選擇和綁定化學協(xié)議和支持。

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