squarix ME043.1說明書 

目錄號編號ME043.1（RPA.1）(1 mg)

目錄號編號ME043.2（RPA.2）(5 mg)

羅丹明 B-[（1,10-二氮雜菲-5-基）-氨基羰基] 芐酯

• Fe2 + 特異性熒光“傳感器”
• 線粒體特異性
• 線粒體可螯合鐵池的測定
• 線粒體鐵攝取評估
• 病理狀態(tài)下線粒體可螯合鐵池改變的評估
• 線粒體可螯合鐵對生理和病理細胞過程的作用評估
• 鐵減少評估

熒光“鐵傳感器”RPA 和 RDA 選擇性測定活細胞線粒體可螯合鐵

鐵對許多生物過程至關(guān)重要，但也是有害的，因為它促進產(chǎn)生高度破壞性的氧物種。線粒體可螯合鐵被認(rèn)為是導(dǎo)致幾種人類疾病。過去，由于線粒體蓄積不足或鐵選擇性指標(biāo)的細胞分布均勻，試圖測定可螯合鐵的線粒體內(nèi)池存在問題 (Lit 3)。熒光無毒的“鐵傳感器”RPA 和 RDA 是一個，它允許在單個完整線粒體中特異性地確定這種鐵池。它們是評估不穩(wěn)定（“氧化還原活性”）鐵功能的新工具，例如在自由基參與的細胞和組織損傷過程中。

產(chǎn)品信息

RPA 作為生物樣品中 Fe (Ⅱ) 的選擇性、高量子產(chǎn)率熒光標(biāo)記物。透膜化合物的陽離子熒光團允許通過例如熒光顯微鏡進行觀察，并且基于線粒體的負(fù)膜電位，特別是靶向活細胞的線粒體。在無細胞系統(tǒng)中，RPA 熒光 (max 601 nm) 被 Fe2 + 離子強烈化學(xué)計量淬滅。

1,2

1

0,8

0,6

A

例如：564 nm 發(fā)射：603 nm

120 B

100 ·

80 ·

60

RPA (µM)

• 45

0,4

30

40

20 · ·

0,2       20

0 0

· · ·

· · · · ·

450 550 650 750

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

FAS (µM)

A：無細胞系統(tǒng)中 RPA（20 MRPA 的“簡單緩沖液”(SBS)：2 mM 抗壞血酸鹽、0.15%SDS 和 10 mM Tris/HCl，pH 8.2）的吸光度和發(fā)射光譜。

B：Fe2 + 對“SBS”中 RPA (20-45 M) 熒光的影響：Fe2 +，作為添加的儲備液 (1 mM) 中硫酸亞鐵銨/檸檬酸三鈉鹽二水合物 (FAS) 濃度的增加添加。含 20 mM 抗壞血酸鹽，與培養(yǎng)基混合。在 RPA/Fe2 + 復(fù)合物*形成后 2 min，測定含已知濃度 RPA 和 Fe2 + 的培養(yǎng)基部分的熒光（以任意單位 a.u. 表示）。零熒光等于無染料培養(yǎng)基的熒光。

RPA 選擇性蓄積在培養(yǎng)肝細胞的線粒體中 (Lit 1,2)。當(dāng)鐵以膜滲透形式加入細胞時，線粒體內(nèi) RPA 熒光被淬滅。當(dāng)實驗可用的線粒體可螯合鐵時，其增加

加入透膜過渡金屬螯合劑吡哆醛異煙酰腙和 1,10-二氮雜菲后，膜透性降低。這種 RPA 熒光的增加允許使用離體原位校準(zhǔn) (Lit 1) 特異性定量活細胞中的線粒體可螯合鐵。

在細胞系統(tǒng)中的應(yīng)用

RPA 可按 Lit 所述使用。1. 在蓋玻片或 Pentz 小室培養(yǎng)的活細胞與 RPA（0.01-10µM，由 10µM 或 1 mM DMSO 儲備液制備）在 HBBS（“Hanks 平衡 sot 溶液”）中于 37 ℃ 孵育 10-12 min。隨后用無染料 HBBS 清洗細胞 3 次。為了避免 RPA 與小室結(jié)合并改善線粒體負(fù)荷，RPA 負(fù)荷后應(yīng)將細胞轉(zhuǎn)移到第二個（無指示劑）Pentz 小室，再孵育 15 min。在 37 °C 條件下。現(xiàn)在應(yīng)在 37 °C 條件下用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基（例如肝細胞用 HBBS 或 L-15 培養(yǎng)基）覆蓋細胞。使用例如定量激光掃描顯微鏡測定線粒體內(nèi) RPA 熒光。RPA 的紅色熒光在 exc. = 543 nm 處激發(fā)，并通過 exc. = 601 nm 附近的長通濾光片收集。定量和定性測量的掃描參數(shù)取決于用于實驗的顯微鏡系統(tǒng)。通過加入 FeCl3/8-羥基喹啉復(fù)合物 (5-15µM) 或膜滲透性鐵螯合劑，例如 PIH（吡哆醛異煙酸腙，2 mM）或 1,10-二氮雜菲 (2 mM)，開始測定后 5-10 min 可控制可螯合鐵的線粒體內(nèi)水平。對于對照測量，平行培養(yǎng)物上樣含有相同熒光團的鐵不敏感對照 RPAC（羅丹明 B-[（菲-9-基）氨基羰基] 芐基酯）。應(yīng)使用與上述相同的加載條件。

原位校準(zhǔn)

通過比較 PIH (2 mM)“去淬滅”后的線粒體熒光（任意單位）與溶解在“線粒體培養(yǎng)基”中的 RPA 標(biāo)準(zhǔn)品 (5-80µM) 的熒光，測定線粒體內(nèi) RPA 濃度的離體校準(zhǔn)（組成見文獻 1）。為了獲得校準(zhǔn)曲線，將 100µl 已知 RPA 濃度的培養(yǎng)基部分置于細胞實驗中使用的相同蓋玻片上。在無細胞離體測量中，使用與細胞熒光定量測量相同的焦平面和激光掃描參數(shù)。

Fe2 + 誘導(dǎo) RPA 熒光猝滅的離體標(biāo)定

1 mL“線粒體培養(yǎng)基”（見 Lit.1）轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 試管中，37 ℃ 孵育。加入 RPA (20-80µM)。加入新鮮制備的含 20 mM 抗壞血酸鹽的貯備液 (1 mM) 中已知濃度的 FAS（硫酸亞鐵銨/檸檬酸三鈉鹽二水合物）。RPA/Fe2 + 在應(yīng)用期間形成。2 min 孵育時間。通過使用與細胞熒光定量測量和離體校準(zhǔn)相同的焦平面和激光掃描參數(shù)測量 RPA 熒光，獲得校準(zhǔn)曲線。

產(chǎn)品數(shù)據(jù)

產(chǎn)品名稱： RPA

產(chǎn)品代碼： ME043.1 (1 mg) 和 ME043.2 (5 mg)

化學(xué)名稱： 羅丹明 B-[（1,10-二氮雜菲-5-基）-氨基羰基] 芐酯

分子式： C48H44N5O4Br

分子量： 834g/mol

大吸收： max (log) = 564 nm (4.95) ,510-535 寬肩峰

發(fā)射大值： 大值 601 nm

穩(wěn)定性： < 4 ℃，干燥避光儲存

外觀： 紫色固體

純度： > 97% (1H NMR，500 MHz)

淬滅化學(xué)計量學(xué)： RPA/Fe2 + :3:1[mol/mol]

體外毒性： 無毒

使用注意事項

該產(chǎn)物作為生物樣品中 Fe (Ⅱ) 的選擇性、高量子產(chǎn)率熒光標(biāo)記物，尤其是在活細胞的線粒體中。可通過熒光光譜法、熒光板進行測量  讀者，  FACS，  視頻顯微鏡  和  激光掃描顯微鏡。  可在 DMSO 中制備 1 mM-5 mM RPA 儲備液，等份試樣應(yīng)在-20 ℃ 避光保存。當(dāng)在-20 ℃ 下適當(dāng)儲存時，溶液可使用至少 2-3 個月。

訂購信息

*有關(guān)散裝包裝規(guī)格，請咨詢。價格不含運費，請咨詢。 后更新日期：2020 年 1 月

文獻

1. 用新型熒光傳感器選擇性測定活細胞線粒體可螯合鐵；

F. Petrat 等人生物化學(xué)。J. (2002) 362,137-147

1. 冷誘導(dǎo)的肝細胞凋亡：非線粒體可螯合鐵觸發(fā)的線粒體通透性轉(zhuǎn)換；U. Rauen et al.《自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)》2003 年第 35 卷第 12 期第 1664-1678 頁
2. 活細胞中的可螯合鐵池：系統(tǒng)確定的量；F. Petrat et al.生物學(xué)化學(xué)，第 383 卷，第 489-502 頁，2002 年
3. 利用不同鐵結(jié)合親和力的線粒體選擇性熒光鐵指示劑評估可螯合線粒體鐵。U. Rauen 等人ChemBioChem 2007,8,341-352
4. 線粒體烏頭酸酶的氧化失活導(dǎo)致大鼠原代中腦培養(yǎng)物中鐵和 H2O2 介導(dǎo)的神經(jīng)毒性。David Cantu 等人PlosOne，2009 年 9 月，第 4 卷，第 9 期，第 1-9 頁
5. Tryparedoxin 過氧化物酶缺陷使錐蟲發(fā)生鐵噬型細胞死亡。M. Bogacz 等人細胞生物學(xué)，2018 年 7 月
6. 線粒體鐵蛋白限制氧化損傷調(diào)節(jié)線粒體鐵的有效性：Friedreich 共濟失調(diào)的保護作用假說。Alessandro Campanella 等人嗯。摩爾遺傳學(xué)2009,Jan 1;18 (1) :1-11
7. 紅細胞對非轉(zhuǎn)鐵蛋白鐵的攝取。Eugenia Prus 等人貧血。2011;2011:945289
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11. 鐵螯合劑用于治療和預(yù)防缺血事件后的細胞死亡和器官損傷。Hossein Ardehali 等人2016 年。US20170014397A1，
12. 線粒體鐵和能量功能障礙將成纖維細胞和誘導(dǎo)的神經(jīng)元與泛酸激酶相關(guān)的神經(jīng)退行性變患者區(qū)分開來。Paolo Santambrogio 等人疾病神經(jīng)生物學(xué)，第 81 卷，2015 年 9 月，第 144-153 頁
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16. Friedreich 共濟失調(diào)，人淋巴母細胞和成纖維細胞中線粒體不穩(wěn)定鐵無變化。

F. Petrat 等人，J. biology?；瘜W(xué)280,8,February 25,pp. 6701–6708,2005

1. 選擇性抑制細胞質(zhì)而不是線粒體核糖體的氨基糖苷類設(shè)計者表現(xiàn)出耳毒性降低。Timor Baasov 等人，J. biol?；瘜W(xué)289/4，第 2318–2330 頁。2014-01-24