Ludger是一家生物科學(xué)公司，專(zhuān)門(mén)研究糖生物學(xué)的醫(yī)學(xué)應(yīng)用分析技術(shù)。該技術(shù)起源于英國(guó)牛津大學(xué)。它在范圍內(nèi)用于FDA和EMEA批準(zhǔn)的生物藥品的質(zhì)量控制中，并可用于支持IND提交。我們從1999年開(kāi)始運(yùn)營(yíng)，已建立了一個(gè)客戶(hù)群，包括*的制藥和生物技術(shù)公司。

LudgerTagTM DMB唾液酸試劑盒產(chǎn)品指南

Ludger LT-KDMB-A1說(shuō)明書(shū)

Ludger文件編號(hào)LT-KDMB-A1-Guide-v6.3

LT-KDMB-A1的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

應(yīng)用 用于從糖蛋白中釋放唾液酸，并用1,2-二氨基-4,5-亞甲基二氧基苯標(biāo)記。2HCl(DMB)。

染料性質(zhì) 相對(duì)分子量 = 225.07 gmol-1

熒光，λex = 373 nm，λem = 448 nm。

結(jié)構(gòu)

O NH₃Cl

O NH₃Cl

同義詞 DMB；1,2-二氨基-4,5-亞甲二氧基苯2鹽酸鹽；1,3-苯并二氧雜-5,6-二胺2鹽酸鹽；5,6-二氨基-1,3-苯并二氧雜唑2鹽酸鹽

描述 該試劑盒含有用于從糖蛋白中釋放唾液酸的試劑。釋放的唾液酸通過(guò)胺化環(huán)化反應(yīng)與DMB染料結(jié)合。

樣本數(shù)量該試劑盒包含用于多達(dá)22份樣本的試劑和材料，包括唾液酸參比組以及N-乙酰神經(jīng)氨酸和N-羥乙酰神經(jīng)氨酸定量標(biāo)準(zhǔn)品。

樣品量 通常每次分析從50-200µg糖蛋白開(kāi)始。我們建議一式三份分析樣本。

適用樣本 可以標(biāo)記糖蛋白、糖肽或聚糖釋放的任何唾液酸。

儲(chǔ)存條件： Store at -18 ℃下避光儲(chǔ)存。避免熱源、光源和濕氣。提供的試劑至少可穩(wěn)定保存2年。

運(yùn)輸： 產(chǎn)品可在環(huán)境溫度下運(yùn)輸。

處理： 確保使用的任何玻璃、塑料制品或溶劑不含糖苷酶和環(huán)境碳水化合物。所有樣本處理程序均使用無(wú)粉手套，并避免環(huán)境碳水化合物污染。

單瓶試劑開(kāi)封后，應(yīng)立即使用其內(nèi)容物。根據(jù)當(dāng)?shù)匕踩?guī)則，丟棄任何多余部分。

安全性： 僅供研究使用。不用于人體或藥物

請(qǐng)閱讀所有所用化學(xué)品的安全數(shù)據(jù)表(SDS)。涉及標(biāo)記試劑的所有過(guò)程均應(yīng)使用適當(dāng)?shù)膫€(gè)人安全防護(hù)-眼鏡、耐化學(xué)腐蝕的手套（例如腈），并在適當(dāng)?shù)那闆r下在實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)櫥中進(jìn)行。

試劑盒內(nèi)容物

每個(gè)試劑盒包含以下各一瓶：

所需的其他試劑和設(shè)備

• 加熱塊、烘箱或類(lèi)似的干燥器，設(shè)置為80 ℃用于唾液酸釋放；設(shè)置為50 ℃用于唾液酸標(biāo)記反應(yīng)
• 移液器范圍1-1000µL和吸頭
• 真空離心機(jī)
• 反應(yīng)瓶（例如0.5 mL聚丙烯瓶）
• 分析級(jí)水，例如。毫居里
• 如果需要復(fù)制品，則添加唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品[可選]：CM-NEUAC-01；CM-NEUGC-01
• 其他唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品Neu5,9Ac2[可選]： CM-NEU5,9AC-01
• 工藝陽(yáng)性對(duì)照品[建議]：Ludger胎球蛋白糖蛋白 GCP-FET-50U

Ludger Bioquant糖肽 BQ-GPEP-A2G2S2-10U

貼標(biāo)時(shí)間線(xiàn)

LudgerTag™標(biāo)記程序，包括干燥時(shí)間和唾液酸從

分析樣品，通常需要7小時(shí)加上干燥：

程序 時(shí)間

樣品制備 10 min + 干燥(1-2 h)，可在前一天進(jìn)行

唾液酸的釋放 3 h

DMB標(biāo)記 3.5 h

總時(shí)間： 7 h + 干燥

方法

1. 樣品制備
   • 我們建議通過(guò)分析取一式三份樣品。對(duì)于高唾液酸化糖蛋白，使用50µg，對(duì)于唾液酸化水平較低的IgG等樣品，使用高達(dá)200µg。

• 請(qǐng)注意，一些常用于蛋白質(zhì)的鹽/緩沖液可能會(huì)干擾唾液酸分析過(guò)程。這取決于與緩沖液體積相比采集的樣品量（因?yàn)榇罅烤彌_液可能影響酸水解過(guò)程中溶液的酸度）。在我們的  經(jīng)驗(yàn)緩沖液（如PBS）在樣品濃度高于1 mg/mL且采集50-200µg樣品進(jìn)行分析時(shí)不存在問(wèn)題。

• 我們建議您在整個(gè)過(guò)程中對(duì)樣品進(jìn)行多次控制：陽(yáng)性過(guò)程控制糖蛋白：胎球蛋白糖蛋白：GCP-FET-50U陽(yáng)性過(guò)程定量控制糖肽：BQ-GPEP-A2G2S2-10U陰性過(guò)程控制：水

陰性過(guò)程對(duì)照：樣品緩沖液

• 將樣品和過(guò)程控制等分試樣（除非已經(jīng)干燥）置于0.5 mL聚丙烯小瓶中，并在真空離心機(jī)中干燥。

1. 唾液酸釋放
   • 將柱溫箱設(shè)定為80 ℃

• 向樣品和過(guò)程控制小瓶中加入25µL 2M乙酸溶液。

不符合唾液酸標(biāo)準(zhǔn)：Neu5Ac(CM-NEUAC-01)、Neu5Gc(CM-NEUGC-01)、唾液酸參比組(CM-SRP-01)小瓶；或Neu5,9Ac2(CM-Neu5,9，Ac-01)（如使用）。

• 渦旋溶解，然后短暫離心。

• 將樣品和對(duì)照品置于設(shè)定為80 ℃的烘箱中，孵育2小時(shí)(±5 min)。從烘箱中取出，冷卻至室溫。渦旋并短暫離心。

• 從各樣品或過(guò)程對(duì)照品中取5µL，轉(zhuǎn)移至0.5 mL聚丙烯小瓶中，準(zhǔn)備用DMB標(biāo)記。

如果需要，酸釋放樣品可在-20 ℃下儲(chǔ)存至少2天[Ref1]。

1. DMB標(biāo)簽
   • 將柱溫箱設(shè)定為50 ℃。

• 向連二亞*LT-DITHIO-01小瓶中加入440µL巰基乙醇溶液LT-MERCAPTO-01，并通過(guò)移液器吹打混合，直至固體*溶解。

• 將該溶液全部加入DMB Dye LT-DMB-01小瓶中，通過(guò)移液器吹打混勻，直至染料溶解。

避免標(biāo)簽試劑暴露于潮濕和光照條件下，并在60 min內(nèi)使用。

• 向各樣品和過(guò)程質(zhì)控品中加入20µL標(biāo)記試劑，蓋上試管蓋，渦旋混勻，然后短暫離心，確保標(biāo)記溶液在小瓶底部。

• 向各唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品（Neu5Ac、Neu5Gc、唾液酸參比組，必要時(shí)加Neu5,9Ac2）中加入20µL標(biāo)記試劑，蓋上試管蓋，渦旋充分混勻，然后短暫離心，確保標(biāo)記溶液在小瓶底部。

將樣品、對(duì)照品和標(biāo)準(zhǔn)品置于設(shè)定為50 ℃的烘箱中，并在  黑暗。

孵育期間，您可以開(kāi)始調(diào)節(jié)LC，以備分析-參見(jiàn)第4節(jié)。

• 從烘箱中取出小瓶，向各樣品和過(guò)程控制中加入475µL水終止反應(yīng)

向各唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品中加入480µL水

1. LC分析

稀釋用于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的Neu5Ac和Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品（使用表1作為指導(dǎo)，因?yàn)镹eu5Gc的含量通常低于Neu5Ac，Neu5Gc曲線(xiàn)的范圍比Neu5Ac低一個(gè)步驟）?；靹?。

這可以在“HPLC條件色譜柱”運(yùn)行正在進(jìn)行時(shí)完成。

表1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋方案

• 用水（20µL樣品 + 180µL水）以1:10（比例1:9）稀釋樣品。

• 用水以1:10（比例1:9）稀釋工藝對(duì)照品（和Neu5,9Ac2，如使用）。

• 請(qǐng)勿稀釋唾液酸參比盤(pán)(SRP)。

注：如果已知樣品具有低水平的唾液酸化（例如IgG）-則不要用水稀釋。如果發(fā)現(xiàn)LC峰面積不在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍內(nèi)，則制備濃度更高的樣品或延長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器中于10 ℃避光條件下可穩(wěn)定至少72 h[Ref2]。

• 準(zhǔn)備LC系統(tǒng)。確保溶劑管線(xiàn)已預(yù)充。溶劑A = 乙腈：甲醇：水(9:7:84)

溶劑B = 乙腈

熒光：激發(fā)波長(zhǎng)：373 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：448 nm；柱溫 = 30 ℃；樣品溫度 = 10 ℃

表2.采用LudgerSep-R1色譜柱（4.6 x 150 mm，3µm顆粒）LS-R1-4.6 x 150進(jìn)行HPLC分析的30 min運(yùn)行方法。

進(jìn)樣量 = 25µL。

表3使用LudgerSep-uR2色譜柱（2.1 x 100 mm，1.9

µm微粒）LS-UR2-2.1 x 100。

進(jìn)樣量 = 5µL。

• 通過(guò)運(yùn)行適當(dāng)方法（表2采用LudgerSep-R1色譜柱進(jìn)行HPLC分析或表3采用LudgerSep-uR2色譜柱進(jìn)行UHPLC分析）處理色譜柱，不進(jìn)樣2/3次。然后進(jìn)樣水系統(tǒng)空白，并檢查基線(xiàn)是否穩(wěn)定。如果不是，則保持流水進(jìn)樣直至基線(xiàn)穩(wěn)定，或在再調(diào)節(jié)前用10%a和90%B清洗30 min。

• 然后運(yùn)行2次或更多次SRP唾液酸參比組進(jìn)樣，直至圖譜重疊。圖譜應(yīng)類(lèi)似于圖1(HPLC)或圖2(UHPLC)。然而，保留時(shí)間將根據(jù)使用的LC系統(tǒng)而變化。

• LC系統(tǒng)現(xiàn)在可以運(yùn)行樣品組。我們建議按以下順序（表4）：

表4.樣品進(jìn)樣順序

1. 驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)
   • 樣品集開(kāi)始和結(jié)束時(shí)SRP的曲線(xiàn)應(yīng)重疊，漂移極小

例如：±0.1 min。

• Neu5Gc和Neu5Ac的校準(zhǔn)曲線(xiàn)R2值應(yīng) > 0.99。
• 根據(jù)內(nèi)部SOP分析的胎球蛋白的Ludger可接受范圍為252-377 nmol/mg蛋白（其中，例如34µg胎球蛋白/50U）[參考文獻(xiàn)3]。當(dāng)我們收集更多GCP-FET-50U的內(nèi)部數(shù)據(jù)時(shí)，對(duì)該可接受標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了更新。歷史可接受范圍列于參考文獻(xiàn)3中，并附有詳細(xì)說(shuō)明。
• 采用內(nèi)部SOP分析的GPEP-A2G2S2的Ludger可接受范圍為5.6-8.4 nmol。

（這是通過(guò)定量NMR測(cè)定的量±20%）

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00

分鐘

圖1：在LudgerSep-R1 HPLC色譜柱上運(yùn)行的DMB標(biāo)記唾液酸參比組(CM-SRP-01)的色譜圖。

峰：1 =  Neu5Gc；  2  =  Neu5Ac；  3  =  Neu5,7Ac2；  4  =  Neu5Gc，9Ac；  5  =  Neu5,8Ac2；  6  =  Neu5,9Ac2；7 = Neu5,x,xAc3（其中x是未知的乙酰基位置）；* = 試劑。

注：該色譜圖僅作為示例提供。峰寬、分離度和保留時(shí)間取決于您實(shí)驗(yàn)室的HPLC系統(tǒng)設(shè)置。

0.00 1.25 2.50 3.75 5.00 6.25 7.50

分鐘

圖2：在LudgerSep-uR2 UHPLC色譜柱上運(yùn)行的DMB標(biāo)記唾液酸參比組。

峰：1 =  Neu5Gc；  2  =  Neu5Ac；  3  =  Neu5,7Ac2；  4  =  Neu5Gc，9Ac；  5  =  Neu5,8Ac2；  6  =  Neu5,9Ac2；7 = Neu5,x,xAc3（其中x是未知的乙酰基位置）；* = 試劑。

注：該色譜圖僅作為示例提供。峰寬、分離度和保留時(shí)間取決于您實(shí)驗(yàn)室的UHPLC系統(tǒng)設(shè)置。

參考文獻(xiàn)和相關(guān)文獻(xiàn)

1. Ludger文件：S-GP-0048-WG-50381-Report-v1.0，DMB標(biāo)記唾液酸冷凍影響的測(cè)定。
2. Ludger文件：唾液酸分析的胎球蛋白質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)-v2.0.唾液酸分析中胎球蛋白系統(tǒng)適用性標(biāo)準(zhǔn)品可接受標(biāo)準(zhǔn)的確定
3. Ludger文件：DMB-kit-Validation-Report-GP-0057-v1.0，采用Ludger標(biāo)準(zhǔn)對(duì)DMB套件進(jìn)行確認(rèn)。
4. Ludger文件：關(guān)于“定量唾液酸分析”#APN002的應(yīng)用說(shuō)明

反應(yīng)機(jī)制

標(biāo)記反應(yīng)是一個(gè)2步過(guò)程。

1. 首先是將閉環(huán)（環(huán)狀）唾液酸平衡為開(kāi)環(huán)（無(wú)環(huán)）形式。
2. 第二步遵循多步機(jī)制，其中DMB染料的伯氨基與α-酮酸的羰基反應(yīng)形成亞胺，該中間體與溶液中的還原劑反應(yīng)，從而與染料的其他伯胺反應(yīng)。重排得到熒光標(biāo)記的唾液酸（二亞胺）。

故障排除

1. HPLC上的低信號(hào)。
   • 酸水解不*：我們建議使用烘箱而不是加熱塊進(jìn)行酸水解步驟。一些加熱塊導(dǎo)致樣品瓶蓋中的酸蒸發(fā)和冷凝，導(dǎo)致酸水解不*。我們還建議使用體積不超過(guò)0.5 mL的小樣品瓶進(jìn)行酸水解。
   • 樣品中的鹽干擾標(biāo)記：鹽和緩沖液可能干擾唾液酸

標(biāo)記方法。如果懷疑鹽干擾樣本，分析前在無(wú)鹽溶劑中透析樣本。

1. 色譜圖中存在高水平的游離染料峰。
   • 這可能是由過(guò)多的光暴露引起的。確保孵育步驟在暗處進(jìn)行。一旦樣品被標(biāo)記，應(yīng)立即在LC上運(yùn)行，以避免降解，因?yàn)闃悠烽L(zhǎng)時(shí)間暴露于光照和高溫會(huì)導(dǎo)致非唾液酸特異性色譜峰增加。該問(wèn)題也可能是由LC色譜柱隨時(shí)間的污染引起的，見(jiàn)下文。
   • 當(dāng)DMB標(biāo)記樣品時(shí)，Neu5Ac和Neu5Gc的量顯示穩(wěn)定

如果校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下儲(chǔ)存并同時(shí)進(jìn)行分析，則在10 ℃下避光儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)72小時(shí)[參考文獻(xiàn)3]。如果不可能，則DMB標(biāo)記的樣本可以冷凍長(zhǎng)達(dá)2天[參考1]。

1. LC色譜峰保留時(shí)間的變化；基線(xiàn)不穩(wěn)定。
   • 錯(cuò)誤或舊LC溶劑。始終以相同的方式制備溶劑（使溶劑達(dá)到  例如，通過(guò)將兩種溶劑混合在一起，量筒中的體積為1 l，與單獨(dú)測(cè)量?jī)煞N溶劑并在瓶中混合不同）。等度梯度對(duì)溶劑制備的變化特別敏感。由于蒸發(fā)，溶劑組成可能隨時(shí)間變化。
   • 過(guò)量游離染料/肽等污染色譜柱可導(dǎo)致保留時(shí)間偏移

和色譜圖上的額外峰。對(duì)于唾液酸化水平較低的樣品（將大量蛋白進(jìn)樣至色譜柱中），這可能更成問(wèn)題。用正常流動(dòng)溶劑和乙腈的10:90混合物在正常流速下清洗色譜柱。

• (U)HPLC系統(tǒng)的運(yùn)行條件尚未優(yōu)化。一個(gè)常見(jiàn)變量

評(píng)估您是否使用UHPLC，是“強(qiáng)/弱清洗”。這些可能對(duì)色譜產(chǎn)生顯著影響。作為一般規(guī)則，“弱清洗”使用弱梯度條件，“強(qiáng)清洗”使用強(qiáng)梯度條件。您需要評(píng)估其中哪些提供了與產(chǎn)品指南相匹配的SRP跟蹤。我們建議通過(guò)以下方式開(kāi)始LC優(yōu)化  弱洗液。

1. 問(wèn)題：標(biāo)簽溶液中有沉淀
   • 盡管罕見(jiàn)，但在DMB標(biāo)記溶液（連二亞*、巰基乙醇和DMB染料的混合物）的制備過(guò)程中可能會(huì)形成輕微沉淀。我們還觀察到了這種情況，檢測(cè)了該混合物的標(biāo)記效率，并可以證實(shí)沉淀物不會(huì)影響標(biāo)記反應(yīng)。
2. 唾液酸參比組(SRP)(U)HPLC軌跡與指南中的不匹配
   • 確保該參比標(biāo)準(zhǔn)品未進(jìn)行酸處理。酸處理后，SRP軌跡將僅包含Neu5Ac和Neu5Gc對(duì)應(yīng)的峰。

保證和責(zé)任

Ludger保證上述產(chǎn)品符合隨附的分析文件。如果產(chǎn)品因誤用以外的原因失效，Ludger將根據(jù)其選擇免費(fèi)更換或退還購(gòu)買(mǎi)價(jià)格。本保證是排他性的，Ludger不作任何其他明示或暗示保證，包括任何暗示條件或任何特定用途的適銷(xiāo)性或適用性保證。

Ludger不對(duì)任何附帶、后果性或或或或有損失負(fù)責(zé)。本品僅用于體外研究。