雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒 (高通量）說明書

上海起發(fā)生物科技有限公司（Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.）屬于上海起發(fā)實驗試劑有限公司（2009年成立）旗下的子公司，成立的初衷是建立上海起發(fā)生物自有品牌，打造優(yōu)質(zhì)的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時，把好生物產(chǎn)業(yè)鏈中的國產(chǎn)生物試劑品質(zhì)關(guān)。未來讓每一個和我們一樣擁有民族情懷的企業(yè)，共同創(chuàng)世界優(yōu)秀的中國生物制造企業(yè)，圓夢中國。

產(chǎn)品詳情

產(chǎn)品描述

報告基因檢測常用于研究真核生物基因表達調(diào)控，螢火蟲螢光素酶 和海腎螢光素酶可以分別催化底物螢光素(luciferin)和腔腸素(coelenterazine)發(fā)出生物螢光(bioluminescence)，這種發(fā)光反應具有良好的光學特征和濃度線性范圍，同時檢測的靈敏度高，可達到 10-20mol。兩種催化反應最適濃度不同，因此互不干擾， 配合使用形成一套高靈敏的雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)，其中海腎螢光素酶常作為內(nèi)參照。

螢火蟲螢光素酶是一種分子量約為 61 kDa 的蛋白，在 ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，催化 luciferin 氧化成 oxyluciferin，在此過程中會發(fā)出波長約為 560 nm 的生物螢光。海腎螢光素酶是一種分子量約為 36 kDa 的蛋白，在氧氣存在的條件下，催化腔腸素(Coelenterazine)氧化成 coelenteramide，在此過程中會發(fā)出波長約為 480 nm 的生物螢光。在后加入海腎螢光素酶底物時，可有效淬滅螢火蟲熒光素酶催化 luciferin 的發(fā)光，而不干擾海腎螢光素酶的活性，從而實現(xiàn)雙螢光素酶報告基因檢測。生物螢光可以通過化學發(fā)光儀(luminometer)或)或多功能酶標儀進行測定。通過螢光素酶與其底物催化發(fā)光的體系，可以高效、靈敏地檢測基因的表達。檢測原理如圖所示：

圖 1.熒光素酶報告基因反應原理圖

產(chǎn)品組成

試劑盒組分：

運輸與保存

冰袋運輸，-20℃保存 6 個月，-80℃保存更長時間。

實驗步驟

1. 試劑準備：

（1）1x Universal lysis Buffer（ULB）配置：取所需體積的 5x Universal lysis Buffer 臨用前用三蒸水稀釋至1x；

（2）Fluc buffer A 工作液：試劑盒開始啟用時，將 Fluc buffer A 全部加入到 Fluc substrate 中，適當吹打搖勻至粉末充分溶解后，分裝到棕色管中-20℃保存?zhèn)溆茫?/span>

（3）Rluc Buffer B 工作液：臨用前取 50x Rluc substrate 用 Rluc Buffer B 稀釋至 1x 用（按需配置），配置好的 Rluc Buffer B 工作液在 2-3 h 內(nèi)使用有效（試劑配置過程中注意避光）。

2. 細胞裂解:

（1） 細胞裂解：取出孔板放置至恢復室溫，加入適量體積 1x ULB 振蕩器搖勻，室溫裂解 15min。細胞裂解液推薦使用量：

（2） 熒光酶標儀設(shè)定，正確開啟儀器，點擊檢測，選擇生物發(fā)光檢測功能，根據(jù)本批樣本的靈敏度選擇合適增益與積分時間，默認為增益 135，積分時間 10 s。

3. 檢測：

1)移液槍吹打混勻裂解液后，吸取 20 μL 到黑色孔板底部。（樣品數(shù)量過多時候建議使用移液槍經(jīng)轉(zhuǎn)移和后續(xù)加液操作，若使用四周不透光的培養(yǎng)板可省略轉(zhuǎn)移操作）

2)向每孔中加入 100 μL Fluc buffer A，輕柔快速吹打混勻三次后，室溫孵育反應 5-10min 后，上機檢測記錄發(fā)光值（F 值）。

  3)向每孔中加入 100 μL Rluc buffer B，輕柔快速吹打混勻三次后，室溫孵育反應 5-10min 后，上機檢測記錄發(fā)光值（R 值）。

（為保證結(jié)果準確性，在加入 Fluc buffer A 或Rluc buffer B 后，請在 1h 內(nèi)完成檢測）

實驗案例分析

在 96 孔板中接種適量細胞過夜至貼壁狀態(tài)，第二天進行如下轉(zhuǎn)染：1.含有FXR 基因啟動子區(qū)的熒光素酶報告基因表達載體質(zhì)粒；2.含有 FXR 基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子 E2 功能的重組表達載體質(zhì)粒；3.海參熒光素酶重組表達載體質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染 6h 向每孔中加入不同單體藥物培養(yǎng) 48h，其中設(shè)置空白溶劑 DMSO 組。最后按試劑盒說明書操作裂解隨后進行熒光素酶報告基因活性檢測，結(jié)果如下（對應孔中所標白色字體數(shù)值為陽性激動劑的激動倍數(shù)）

圖 3 . 59 種單體藥物對X 基因啟動子區(qū)熒光素酶報告基因激動倍數(shù)熱圖（A1:為空白溶劑對照組；A2-J6: 59

種 FDA 上市藥物的實驗組）

經(jīng)過上述實驗的高通量篩選確定 F3 孔對應單體藥物對FXR 啟動子區(qū)激動效果強，激動倍數(shù)為 45。同某進口“P"品牌一同測定該藥物對FXR 基因的激動曲線，并計算 EC₅₀，結(jié)果如下：

圖 4.紅色：起發(fā)生物品牌測定 F3 單體藥物激動 FXR 基因啟動子區(qū)熒光素酶報告基因響應曲線；黃色：進口“P"品牌測定F3 單體藥物激動 FXR 基因啟動子區(qū)熒光素酶報告基因響應曲線（EC50）

1. 數(shù)據(jù)分析：

（1）實驗設(shè)計：根據(jù)實驗目的，每組實驗均應設(shè)置空白對照組，對照組和處理組。

a. 空白對照組

背景 F：未轉(zhuǎn)染細胞裂解液+ Fluc buffer A。

背景 R：未轉(zhuǎn)染細胞裂解液+ Fluc buffer A + Rluc buffer B。

注：空白對照組樣品量須與實驗樣品量相同，且與實驗樣品含有相同的培養(yǎng)基/血清組合。

b. 對照組：轉(zhuǎn)染細胞未經(jīng)實驗因素處理 (即對照組 F 和對照組 R)。

c. 實驗組：轉(zhuǎn)染細胞經(jīng)實驗化合物處理 (即實驗組F 和實驗組 R)。

計算結(jié)果：對照組比值=(對照組 F-背景 F)/(對照組 R-背景 R)，實驗組比值=(實驗組 F-背景 F）/(實驗組 R-背景 R)。

表達倍數(shù)= 實驗組比值/對照組比值。

注意事項

（1） 反應溫度：酶促反應對溫度較為敏感，加樣檢測前務必將檢測試劑以及細胞培養(yǎng)液平衡至室溫（20-25℃）。

（2） 檢測儀器：能檢測化學發(fā)光的儀器都適用，但由于不同儀器的設(shè)置和靈敏度不同，測得的光信號值也會不同。 檢測板：為防止孔間干擾，推薦使用不透光酶標板。

（3） 發(fā)光信號會受到檢測環(huán)境如培養(yǎng)基組分、溫度等影響，應確保同組內(nèi)不同樣本檢測條件一致。

（4） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套。

（5） 本產(chǎn)品僅作科研用途！