KOD-Plus-Neo是基于一種ji端嗜熱的海洋古生菌Thermococcus kodakarensis的DNA聚合酶。這種聚合酶由于其高效的3’-5’核酸外切酶活性（校對活性）。該產(chǎn)品含有一種du特的“延伸增強劑"，可抑制傳統(tǒng)PCR產(chǎn)生的“平臺效應(yīng)"。因此，與先前版本的KOD-Plus（KOD-201）相比，該試劑表現(xiàn)出更高的擴增效率和延伸能力。此外，這種酶對于PCR延伸步驟僅需要30秒/kb。這有利于長片段PCR。這種酶含有兩種抑制聚合酶和3’-5’核酸外切酶活性的抗KOD DNA聚合酶抗體和，從而支持熱啟動PCR。

產(chǎn)品特點

? 比普通Taq DNA聚合酶高80倍的PCR保真度。

? 與傳統(tǒng)PCR相比，“延伸增強劑"能夠?qū)崿F(xiàn)更高的擴增效率和延伸能力。

? PCR延伸步驟只需要30秒/kb。

? 兩步循環(huán)條件可用于使用≥20 mer引物的擴增（退火溫度，Tm>63°C）。

產(chǎn)品組分

引物設(shè)計

? 引物應(yīng)為22-35個堿基，Tm>63℃

? 引物的最佳GC含量為45-60%。5’端和3’端的理想GC含量分別為60-70%和40-50%。

? 長片段擴增的引物應(yīng)為25-35個堿基，Tm>65°C。

? 不能使用含有肌苷的引物

? 建議使用最近鄰法計算引物的Tm。本手冊中的Tm值是使用以下參數(shù)使用該方法計算的。Na⁺濃度：50 mM 寡核苷酸濃度：0.5 µM

PCR產(chǎn)物的克隆

? KOD-Plus-Neo由于其3’-5’核酸外切酶活性。因此，PCR產(chǎn)物為平端產(chǎn)物，可以根據(jù)平端克隆方法進行克隆。

? KOD-Plus-Neo的PCR產(chǎn)物應(yīng)在限制性內(nèi)切酶處理之前進行純化。KOD DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性在PCR反應(yīng)結(jié)束時仍然存在。

? 克隆KOD DNA聚合酶產(chǎn)生的平端PCR產(chǎn)物推薦專用TA克隆試劑盒“TArget clone™ -Plus- (Code No. TAK-201)"

實驗步驟

1. 標準反應(yīng)體系配置

反應(yīng)物準備前，除酶溶液外，所有成分均應(yīng)wan全解凍。

**不要使用其它試劑盒或其它公司的dNTP

注意：

最佳引物濃度為0.3 µM。在長片段（≥10kb）的情況下，降低引物濃度（0.15µM）可能會產(chǎn)生更有效的擴增。

二甲基亞砜DMSO（終濃度2-5%）的添加有利于擴增富含GC的靶標。在DMSO存在的情況下，PCR保真度不會降低（參見步驟2，循環(huán)條件）。

cDNA或基因組DNA中的污染RNA會通過螯合Mg2+來抑制PCR反應(yīng)。應(yīng)使用<200 ng RNA的模板DNA進行PCR。

模板DNA的質(zhì)量應(yīng)通過電泳檢查。模板DNA的長度和純度會影響擴增結(jié)果。

含有尿嘧啶的模板不能用于擴增。

對于PCR反應(yīng)，建議使用薄壁管。建議總反應(yīng)體積為50 μL。

2. 循環(huán)條件

推薦≥20 mer的引物，Tm>63°C的兩步循環(huán)條件用于有效擴增。

兩步循環(huán)：

如果引物的Tm值超過63°C，建議采用兩步循環(huán)。

注意：

對于使用低拷貝模板的擴增或長片段（>10kb）的擴增，更長的延伸時間（高達1 min/kb）或更高的Mg²⁺濃度（高達2 mM終濃度）可以提高產(chǎn)率。

二甲基亞砜DMSO（終濃度2-5%）的添加可能有利于擴增富含GC的片段。所用DMSO的濃度應(yīng)根據(jù)引物的Tm來確定。

<25 mer or Tm <68℃: 加2%

≥25 mer or Tm ≥68℃: 加5%

如果擴增失敗，可能需要3步循環(huán)

三步循環(huán)：

當引物的Tm小于63℃時，應(yīng)使用三步循環(huán)。

注意：

對于使用低拷貝模板的擴增或長片段（>10kb）的擴增，更長的延伸時間（高達1 min/kb）或更高的Mg²⁺濃度（高達2 mM終濃度）可以提高產(chǎn)率。

二甲基亞砜DMSO（終濃度2-5%）的添加可能有利于擴增富含GC的片段。

降落PCR：

如果在2步和3步循環(huán)條件下觀察到非特異性擴增（在PCR產(chǎn)物電泳后觀察到額外的條帶），降落PCR則可以提高特異性。

注意：

對于使用低拷貝模板的擴增或長片段（>10kb）的擴增，更長的延伸時間（高達1 min/kb）或更高的Mg²⁺濃度（高達2 mM終濃度）可以提高產(chǎn)率。

二甲基亞砜DMSO（終濃度2-5%）的添加可能有利于擴增富含GC的片段。所用DMSO的濃度應(yīng)根據(jù)引物的Tm來確定。

<25 mer or Tm <68℃: 加2%

≥25 mer or Tm ≥68℃: 加5%

應(yīng)用實例

性能數(shù)據(jù)：

1. PCR保真度

用TArget克隆技術(shù)對從人基因組DNA中擴增的人β-珠蛋白基因產(chǎn)物進行序列分析，測定突變頻率。KOD-Plus-Neo表現(xiàn)出ji好的保真度，突變頻率與以前版本的酶（KOD-Plus-）相同。

2. 延伸能力

根據(jù)每種酶的推薦條件，通過幾種PCR酶從人類基因組DNA中擴增出各種大小的片段。KOD-Plus-Neo成功擴增了17.5 kb的片段。

3. 低拷貝模板擴增

使用0.5 ng cDNA模板擴增四個基因。模板由HeLa細胞的總RNA合成。KOD-Plus-Neo成功擴增了所有基因。

4. 延伸速度

不同的擴增時間從人類基因組DNA（50ng）中擴增β-珠蛋白基因（3.6 kb）。KOD-Plus-Neo可以用30秒/kb的延長時間擴增3.6 kb的靶標。

應(yīng)用數(shù)據(jù)：

1. 各種蛋白激酶片段的擴增

利用HeLa細胞總RNA合成的cDNA擴增各種蛋白激酶開放閱讀框。KOD-Plus-Neo成功擴增了所有片段。

2. 長片段擴增

使用不同濃度的引物從人類基因組DNA中擴增長片段。過多的引物會抑制擴增。因此，應(yīng)使用約0.15 µM的較低引物濃度擴增長片段（>10 kb）。

常見問題及解決辦法

參考文獻

1) Takagi M, Nishioka M, Kakihara H, Kitabayashi M, Inoue H, Kawakami B, Oka M, and Imanaka T., Appl Environ Microbiol., 63: 4504-10 (1997).

2) Hashimoto H, Nishioka M, Fujiwara S, Takagi M, Imanaka T, Inoue T and Kai Y, J Mol Biol., 306: 469-77 (2001).

3) Mizuguchi H, Nakatsuji M, Fujiwara S, Takagi M and Imanaka T, J Biochem., 126: 762-8 (1999).

4) Fujii S, Akiyama M, Aoki K, Sugaya Y, Higuchi K, Hiraoka M, Miki Y, Saitoh N, Yoshiyama K, Ihara K, Seki M, Ohtsubo E and Maki H, J. Mol. Biol., 289: 835-850 (1999).

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