用于樹(shù)突和樹(shù)突棘浸染的GOLGT-COX染色系統(tǒng)

                              于體外研究

    Bioenno Golgi Kit是一種基于高爾基染色法設(shè)計(jì)出來(lái)的試劑盒，用于浸染神經(jīng)元樹(shù)突和樹(shù)突棘（參見(jiàn)下面的參考文獻(xiàn)）。該試劑盒在大鼠、小鼠、貓、兔和猴子以及人類死亡后所獲得的新鮮腦組織上進(jìn)行了廣泛多次的測(cè)試，確定了該試劑盒能將樹(shù)突和樹(shù)突棘穩(wěn)定和高質(zhì)量的染色（見(jiàn)圖A-C）。大多數(shù)神經(jīng)元根據(jù)其組織年齡大小，用該試劑盒浸漬需要7-14天（見(jiàn)表2）。試劑盒儲(chǔ)存在室溫（4-25ºC）下的黑暗區(qū)域。

圖中為用Bioenno Golgi Kit侵染的樹(shù)突分支和樹(shù)突棘

（A）：低倍率（4×物鏡）顯微鏡照，顯示海馬體中高爾基體浸漬的神經(jīng)元。

（B）：從尾狀后肌取出的紋狀體神經(jīng)元。左側(cè)面板框架區(qū)域中的樹(shù)突棘（20×），在右側(cè)圖片中放大顯示（箭頭，63×）。

（C）：從皮質(zhì)采取的錐體神經(jīng)元。 中間面板框架區(qū)中樹(shù)突分支上的樹(shù)突棘（20×）被放大顯示在 斜（左，100×）和 主（右，100×）中。 這個(gè)階段常觀察到類似絲狀偽足的突起（左側(cè)圖片的箭頭）。

參考文獻(xiàn)：

• Ramón-Moliner E: The Golgi-Cox technique. In Nauta WJH and Ebbesson SOE (eds.), Contemporary Methods in Neuroanatomy. pp 32–55, New York: Springer, 1970.

• Glaser ME and Van der Loos H: Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: application of a new,high clarity Golgi-Nissl stain. J Neurosci Methods 1981, 4:117–125.

• Kolb B, Ladowski R, Gibb R, Gorny G. Does dendritic growth underlie recovery from neonatal occipital lesions in rats? Behav Brain Res 1996, 77:125–133.

• Gibb R and Kolb B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods 1998, 79:1–4.

保質(zhì)期：套件中的物品保質(zhì)期為自購(gòu)買之日起的12個(gè)月之內(nèi)。

退貨政策：Bioenno Tech對(duì)此產(chǎn)品的退貨政策是自購(gòu)買之日起90天之內(nèi)。

免費(fèi)技術(shù)支持：

隨套件提供的材料：

•溶液A：浸漬溶液（240 ml×2瓶）。溶液A是工作液，在底部看到沉淀物是正?，F(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)只需使用其上清液。

•試劑B：用于制備兩種工作緩沖液。

緩沖液1：浸漬后緩沖液（30 g×5 瓶）制備方法：在90 ml dH₂O中稀釋 30g 試劑B

緩沖液2：收集和安裝緩沖液（30 g×5 瓶）制備方法：在500 ml dH₂O中稀釋30 g試劑B

工作緩沖液可在4ºC下儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)4周。

•溶液C：染色溶液（220 ml×2 瓶）。所提供的溶液C需在使用前用dH₂O（體積比為3：5）稀釋。

例如，18ml溶液C + 30ml dH₂O→48ml工作液，試劑盒中提供染色罐可剛好裝下所制備的48ml工作液。 48ml工作液可用于多達(dá)120個(gè)切片（例如，在所提供的染色罐中總共有10個(gè)載玻片，每個(gè)載玻片黏附有12個(gè)鼠腦切片）。

•試劑D：復(fù)染緩沖液（90 g×2 瓶）。使用前需用dH₂O稀釋試劑。

在500 ml dH₂O中稀釋90 g試劑D形成工作液。工作液可在室溫下儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月。

48ml工作液可用于多達(dá)120個(gè)切片（例如，如上所述在染色罐中的12個(gè)切片×10個(gè)載玻片）。

•還包含：

著色筆（大，扁平，1 只），用于切片轉(zhuǎn)移;

圓頭筆（小，1 個(gè)），用于切片安裝;

帶蓋的染色罐（2個(gè)），用于存儲(chǔ)，染色和清洗粘連在粘性顯微鏡載玻片上的切片。

套件不提供的必要材料：

蒸餾水或去離子水（dH₂O）;

0.01M PBS-T（見(jiàn)表1）;

塑料或玻璃管和瓶子;

塑料鉗;

組織學(xué)用品和設(shè)備：粘合劑，顯微鏡載玻片，蓋玻片，光學(xué)顯微鏡，震動(dòng)切片機(jī)或微切片機(jī)，乙醇，二甲苯或二甲苯替代品，Permount®封片劑。

表1：制備0.01M PBS-T，需先配制0.1M PB（左），然后配制含有0.3％Triton X-100的PBS（右）。

存儲(chǔ)、安全和處理注意事項(xiàng)：

·•將試劑盒存放在室溫下。

·•試劑盒中的溶液A和C為含劇毒試劑。 需在通風(fēng)櫥中準(zhǔn)備并使用，使用完后收集所有廢物。

•  套件A中含有用于危險(xiǎn)廢物處理的瓶子。

·•在處理試劑盒試劑時(shí)，需戴上手套，眼睛和面部有適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)以及穿戴合適的防護(hù)服，處理后需*清洗雙手。

·•處理時(shí)避免試劑的吸入和接觸皮膚，眼睛。 如接觸，立即用水*清洗，必要時(shí)尋求醫(yī)療援助。

建議：

·•在處理溶液A和C時(shí)使用帶蓋的玻璃或塑料容器。

·•始終保持容器密閉。不要使用金屬工具來(lái)承裝溶液A。

·•使用溶液A，C或D處理大腦或切片時(shí)，避免大腦或切片受光照影響。

·•不要重復(fù)使用或稀釋工作液，在室溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以獲得宜效果。

1.浸漬：將剛收獲的腦組織浸入溶液A中。溶液A的體積大約是組織塊體積的10倍。 例如， 20ml溶液A對(duì)應(yīng)成年大鼠腦（1cm×1cm×2cm）體積。

浸泡1~2天后更換溶液，并在室溫下繼續(xù)避光浸漬（建議浸漬天數(shù)見(jiàn)表2）。

意見(jiàn)建議：為了獲得宜侵染，建議用生理鹽水灌注動(dòng)物，清除組織中的血液。 麻醉動(dòng)物（例如用戊巴匕匕妥鈉，腹膜內(nèi)注射100mg / kg）。心臟內(nèi)或升主動(dòng)脈用0.9％生理鹽水（例如 1000ml dH₂O中含有9g NaCl）灌注至內(nèi)臟血液量被沖洗掉。灌注通常需要3~5分鐘。 解剖大腦并將其謹(jǐn)慎地從頭骨上移除。用鋒利的刀片切割大腦至1厘米左右的厚度，在0.9％鹽水中短暫沖洗，然后浸入溶液A.

表2：20-22℃下建議的浸漬總天數(shù)（P：出生后一天; 如：P2表示“2天齡”）

組織塊的類型和大小的不同可能影響浸漬時(shí)間，理想的時(shí)間應(yīng)該通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究獲得。在大多數(shù)情況下較好的浸漬效果是在2周。如果浸漬超過(guò)2周，則可能出現(xiàn)非特異性染色體。

2.浸漬后：浸漬準(zhǔn)備好后，用蒸餾水或去離子水（dH₂O）沖洗組織塊，然后將其轉(zhuǎn)移到套件B所制備的浸漬后緩沖液（30 g稀釋在90 ml dH₂O）中，并在室溫下避光儲(chǔ)存。 在浸泡一天后更新溶液，繼續(xù)浸泡一天。 在浸漬后2天后，將組織塊準(zhǔn)備好切片。

組織塊可以在4°C的緩沖液中儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)1個(gè)月

3.切片：可以使用振動(dòng)切片機(jī)或類似類型的切片機(jī)將大腦切割成厚度為100-200μm的切片。

切片應(yīng)收集在套件B所制備的收集和安裝緩沖液（30g試劑B，在500ml dH₂O中稀釋）中。

建議使用振動(dòng)切片機(jī)或微切片機(jī)進(jìn)行切片。如果切片機(jī)刻度范圍為1-10，則將速度和振幅設(shè)置為4級(jí)。 建議在分析樹(shù)枝狀分枝和樹(shù)突棘時(shí)使用100-200μm的厚度。 對(duì)于薄切片的切割（例如50μm），需將剃刀刀片浸入二甲苯中1-2分鐘來(lái)去除刀片上的油漬。

切片過(guò)程可在溫度設(shè)定在-16°C ~ -20°C的低溫恒溫器中進(jìn)行。

4.安裝：借助所提供的著色筆（大），將切片轉(zhuǎn)移到裝有收集和安裝緩沖液的填充盤（例如95×15mm培養(yǎng)皿）中。 使用圓頭筆（小），將切片安裝在粘性顯微鏡載玻片上。 1個(gè)載玻片上可安裝6~12個(gè)切片。

覆蓋切片：用吸水紙（例如濾紙）覆蓋濕的切片，然后通過(guò)輕壓載玻片來(lái)給吸水紙壓力，以增強(qiáng)切片與載玻片的粘附。

在室溫下風(fēng)干燥切片約1分鐘。 長(zhǎng)時(shí)間暴露在干燥空氣中會(huì)導(dǎo)致切片破碎。

將載玻片存放在干燥且封閉的染色罐中（已提供）。 放置在封閉的染色罐中的載玻片可以在室溫下儲(chǔ)存一天。一個(gè)染色罐可以存儲(chǔ)多達(dá)10個(gè)載玻片。

5.染色：用0.01M PBS-T洗滌載玻片20~30分鐘，然后用dH₂O洗滌約1分鐘。 將載玻片置于用dH₂O稀釋后的溶液C（體積比 3：5）中，在封閉的染色罐中保持20±2分鐘（將罐子儲(chǔ)存在黑暗區(qū)域中），然后將載玻片在dH₂O中漂洗約1分鐘。

如“試劑盒提供的材料”中所述：溶液C必須在使用前用dH₂O（體積比為3：5）稀釋。例如，將18ml溶液C與30ml dH₂O混合，形成48ml工作溶液。試劑盒中提供染色罐可剛好裝下所制備的48ml工作液。48ml工作液可用于多達(dá)120個(gè)切片（例如，在所提供的染色罐中總共10個(gè)載玻片，每個(gè)載玻片黏附有12個(gè)鼠腦切片）。

為獲得宜效果，請(qǐng)勿重復(fù)使用稀釋的工作溶液。

為了防止切片滑落，切勿在dH₂O中長(zhǎng)時(shí)間洗滌。理想的染色時(shí)間應(yīng)由實(shí)驗(yàn)研究獲得。通常較好的染色效果是在20分鐘左右。

6.復(fù)染色：將載玻片置于試劑D所制備的復(fù)染緩沖液中，在暗處中放置20分鐘后在0.01M PBS-T中洗滌10分鐘×3次。

（可選染劑：在PBS-T洗滌后，切片可用甲酚紫、甲基綠或其他合適的染色試劑復(fù)染。）

用dH₂O沖洗載玻片約1分鐘，然后風(fēng)干。當(dāng)切片不*干燥（通常需要5~10分鐘）時(shí)，將載玻片存放在干燥且封閉的染色罐中，或繼續(xù)下一步操作“清潔和覆蓋”。

載玻片可以在室溫條件下儲(chǔ)存在罐中一天。

為了防止長(zhǎng)時(shí)間暴露在干燥空氣導(dǎo)致切片的碎片化，需將載玻片存放在干燥且封閉的染色罐中。

48ml復(fù)染緩沖液可用于多達(dá)120個(gè)切片（例如，如“5.染色”中所述，在染色罐中的12個(gè)切片×10個(gè)切片）。 為獲得宜效果，請(qǐng)勿重復(fù)使用工作溶液。

7.清潔和覆蓋：將載玻片在100％乙醇中脫水約10分鐘 ×4次。 在二甲苯或二甲苯替代物中清洗約10分鐘 ×3次。 蓋玻片采用的是Permount®封片劑。

將superGolgi-染色用的切片儲(chǔ)存在室溫和黑暗區(qū)域。